  | |  | Calendrier scientifique – Cas clinique de septembre 2023
Chères clientes, chers clients,
L'image ci-dessus présente un lymphocyte caractérisé par deux technologies différentes : le côté bas illustre la réaction des réactifs de lyse et de fluorescence de la gamme XN-Series et la face du haut évoque l'immunophénotypage multicolore où chaque anticorps réagit avec son antigène respectif à la surface de la cellule, produisant un profil de marquage caractéristique en cytométrie en flux. Pour ce mois de septembre, notre calendrier scientifique met en évidence un cas clinique à la frontière entre l'hématologie et la cytométrie en flux et insiste sur la complémentarité de ces deux technologies dans l'identification d'une leucémie lymphoïde chronique (LLC-B). Vous allez découvrir en quoi la combinaison de l'analyse de la formule leucocytaire, du frottis sanguin et de l'immunophénotypage par cytométrie en flux est essentielle à l'établissement du diagnostic final du patient dans son parcours de soins.
Bonne lecture !
Bien cordialement,
Marketing Scientifique Sysmex France
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| | Identification d'une LLC typique à l'aide de deux technologies complémentaires | |
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| La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est un type d’hémopathie maligne. L'OMS classe la LLC dans les néoplasmes à lymphocytes B matures, touchant principalement le sang périphérique, la moelle osseuse ainsi que les ganglions lymphatiques, le foie et la rate [1]. Avec une incidence de 2 à 6 cas pour 100 000 personnes par an dans le monde occidental, il s’agit de la forme la plus répandue de leucémie chez l’adulte [2], et la plus prévalente, en raison de la survie relativement longue des patients atteints [3,4].
L’aspect principalement monomorphe des lymphocytes est souvent évocateur d’une population cellulaire néoplasique et clonale. Dans une LLC typique, les lymphocytes anormaux sont généralement de petites cellules d'apparence mature avec une faible activité mitotique [1].
À l'exception des cellules tueuses naturelles (lymphocytes NK), la coloration de Pappenhaimer ne permet pas de déterminer la lignée des lymphocytes de manière fiable et seules certaines observations peuvent être réalisées sur le plan morphologique. Caractériser les lymphocytes de manière fiable implique de recourir à un immunophénotypage. Les lymphocytes anormaux de la LLC expriment les antigènes de surface CD19, CD20, CD5, CD23, CD43 et CD200 avec l’expression des chaînes légères kappa ou lambda [5]. Le CD10 est négatif.
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| | Clinique et Biologie | |
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| Un homme de 66 ans consulte son médecin généraliste pour une altération générale de son état de santé. Un échantillon de sang périphérique est alors prélevé et envoyé au laboratoire. L'analyse initiale à l’aide du XN-20 montre une numération plaquettaire normale et l’absence de toute anémie, mais révèle une lymphocytose avec présence de cellules potentiellement malignes.
Un frottis sanguin est effectué et analysé à l'aide du système d'imagerie numérique automatisé DI-60 (Cellavision). Son examen révèle la présence de petits lymphocytes présentant un rapport nucléo-cytoplasmique élevé et une chromatine nucléaire condensée. Des ombres de Gumprecht, typiquement présentes chez les patients atteints de leucémie lymphoïde chronique, sont également observées [6].
Le clinicien envoie alors l'échantillon au laboratoire de cytométrie en flux pour une analyse d’immunophénotypage. L'échantillon, mesuré sur l’analyseur XF-1600, s’est avéré positif aux CD19, CD5, CD20, CD23, CD79b et montre une prolifération monoclonale de la chaîne légère lambda.
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| | Interprétation des scattergrammes et interprétation morphologique | |
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| L'analyse sanguine du patient révèle une forte augmentation de la numération leucocytaire (26,17.103/µL), dont 80 % de lymphocytes (LYMPH# 21,15.103/µL). Ces constatations sont visibles sur le scattergramme WDF, où la population lymphocytaire se présente sous la forme d’un nuage très dense.
Les réactifs employés dans le canal WPC ont un effet de lyse plus marqué sur les membranes leucocytaires que ceux utilisés dans le canal WDF, conduisant ainsi à une plus grande perméabilité cellulaire. Le marqueur fluorescent spécifique utilisé dans le canal WPC marque l'ADN à l'intérieur du noyau de la cellule. Plus le degré de perméabilisation est élevé, plus le marqueur fluorescent peut pénétrer dans la cellule et se fixer à l'ADN, provoquant un signal fluorescent élevé. Les lymphocytes néoplasiques, qui sont plus matures, ont des membranes facilement perméables, en raison de la teneur plus élevée en lipides des membranes cellulaires, et émettent donc un signal de fluorescence élevé. Cette observation se retrouve sur le scattergramme WPC de la figure 1 : la population de lymphocytes néoplasiques forme un ensemble de points rouges dans la zone hautement fluorescente du scattergramme WPC. La vue SSC-FSC du scattergramme WPC montre deux populations lymphocytaires distinctes (populations cellulaires entourées d’un cercle bleu).
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| Figure 1. L’onglet « Lab. Only » de l’IPU du XN montre la formule leucocytaire et les scattergrammes WDF, WNR et WPC.
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| L'analyse morphologique à l'aide d'un analyseur d'imagerie numérique automatisé DI-60 révèle la présence d’ombres de Gumprecht.
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| Figure 2. Imagerie numérique (sur DI-60) révélant la présence d’ombres de Gumprecht.
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| | Interprétation des données d’immunophénotypage | |
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| L'échantillon est prélavé avant coloration, pour exclure du plasma les immunoglobulines étrangères, qui pourraient affecter les résultats finaux. Ensuite, un protocole de lyse/lavage est effectué. De manière succinte :
- Un cocktail d'anticorps est placé dans un tube en polystyrène de 75 mm x 12 mm.
- Un aliquot de 100 µL de l'échantillon lavé est prélevé dans ce même tube et vortexé à 2500 rpm/min pendant 5 secondes.
- Incubation pendant 15 minutes dans l'obscurité à température ambiante.
- 2 mL de CyLyse FX dilués au 1/10 sont ajoutés dans le tube, pour lyser les globules rouges et fixer les globules blancs, et vortexés à 2500 rpm/min pendant 5 secondes.
- Incubation pendant 10 minutes dans l'obscurité à température ambiante.
- L'échantillon est ensuite lavé deux fois avec du PBS et analysé sur XF-1600 pour l’acquisition.
Des interactions anticorps/antigène ont lieu dans l'échantillon et le mélange du cocktail, de sorte que les anticorps monoclonaux se fixent sur l'antigène cible spécifique à la surface cellulaire. Chaque anticorps monoclonal possède un marqueur fluorescent, que le cytomètre en flux détecte. L'utilisateur est ainsi en mesure de distinguer le positif du négatif, et donc de poser un diagnostic.
CyLyse FX est une solution de lyse à base de formaldéhyde qui lyse les globules rouges et fixe les globules blancs avec l'anticorps et le marqueur associés. Sans la lyse, le cytomètre en flux analyserait également les globules rouges, non pertinents pour ce test.
Enfin, l'échantillon est lavé pour exclure les débris de globules rouges de l’acquisition. L’utilisateur dispose ainsi d’une image plus claire lors de l’acquisition de l'échantillon, ce qui garantit une analyse précise des données.
Dans notre cas, l'immunophénotypage révèle une lymphocytose et une population CD19/CD5 doublement positive. De plus, une prolifération monoclonale de la chaîne légère lambda est observée. L'échantillon exprime également le CD20, CD23 et CD79b et est négatif au CD10, CD11c et CD38, ce qui corrobore le diagnostic d'une LLC-B.
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| Figure 3. Graphiques de dispersion des marqueurs lambda, CD19, CD5, CD20 et CD23 provenant de l’analyseur XF-1600 montrant une prolifération monoclonale anormale de lymphocytes B avec des immunoglobulines lambda (en violet).
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| | Pour aller plus loin | |
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| | Références bibliographiques | |
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